Vírusy v službách vedeckého výskumu

Článok je súčasťou rubriky Veda, výskum - naša šanca.

Pandémia Covid-19 spôsobila na celom svete paniku nevídaných rozmerov a na niekoľko rokov ochromila bežné fungovanie každého z nás.

Popri intenzívnej snahe vyvinúť citlivé diagnostické metódy na detekciu vírusu v populácii sa zároveň skúmala aj problematika samotnej biologickej interakcie medzi vírusom a bunkou.

Pre mnohých môže predstava skúmania tejto interakcie pôsobiť ako science-fiction, pretože sledovať tieto procesy v reálnom čase na živých bunkách bolo až donedávna niečo ako hľadať ihlu v kope sena... so zhasnutým svetlom.

Z čoho sa vírus vlastne skladá?

Predstavme si vírus ako sofistikovanú skladačku. Každý dielik predstavuje dôležitú časť, bez ktorej vírusová častica nefunguje správne.

Funkčnosť vírusu závisí od správneho zloženia jednotlivých komponentov do plne funkčnej vírusovej častice. V stručnosti, vírus SARS-CoV-2 sa skladá zo štyroch štrukturálnych proteínov (S, E, M a N), 16 neštrukturálnych proteínov (NSP-1 až NSP-16) a niekoľkých pomocných proteínov.

Iba spojením všetkých týchto komponentov vznikne plnohodnotný vírus, ktorý dokáže rozpoznať príslušný bunkový receptor, preniesť svoju genetickú informáciu do bunky, využiť jej proteosyntetický aparát a efektívne sa množiť.

Jeden vírus, 2 cesty

Na pochopenie spôsobu, akým vírus vstupuje do bunky, si popíšeme dva základné mechanizmy, ktoré SARS-CoV-2 využíva na prenos svojej genetickej informácie.

Aby vírus mohol považovať bunku za vhodný cieľ, musí najprv rozpoznať receptor ACE2 (angiotenzín konvertujúci enzým 2) na jej povrchu. Tu sa začína zaujímavý proces.

Bez zbytočných detailov z biochémie to môžeme zhrnúť takto: ak bunka nemá na povrchu aktívnu transmembránovú serínovú protéazu 2 (tzv. TMPRSS2, enzým, ktorý štiepi proteíny), alebo ak je táto proteáza nedostatočne aktívna, vírus prenikne priamo do bunky procesom, ktorý je známy ako endocytóza. Endocytóza je proces, pri ktorom bunka prijíma látky z okolia tak, že ich obklopí časťou svojej membrány a vtiahne dovnútra do cytoplazmy (vnútorného prostredia bunky). Následne sa po vstupe do bunky uvoľní vírusová RNA, ktorá v intracelulárnom priestore spustí proces replikácie vírusu.

V druhom prípade vstupu do bunky (v prítomnosti TMPRSS2 na povrchu) je proces trochu odlišný. V tomto procese sa uplatňuje schopnosť štiepiť vírusový S proteín prostredníctvom proteázy TMPRSS2. Vo výsledku to spôsobí splynutie membrány vírusu s membránou bunky a uvoľnenie vírusovej RNA do cytoplazmy hostiteľskej bunky.

Sledovanie vírusu v živej bunke

Vyššie spomenuté interakcie vírusu s bunkou, ako aj mnohé ďalšie, sú jedinečné a pomáhajú nám lepšie pochopiť biológiu samotného vírusu. Existujú však technológie, ktoré nám umožňujú sledovať tieto procesy v reálnom čase? Odpoveď je jednoznačne ÁNO. Jednou z možností je tvorba fluorescenčne značených INFEKČNÝCH vírusov.

Je však práca s infekčnými patogénmi vždy ideálna? Na túto otázku neexistuje jednoznačná odpoveď. Práca s infekčnými materiálmi vyžaduje špeciálne priestory a prísne protokoly. Bežne sa vyžaduje certifikácia laboratórií na úrovni BSL-3, čo nie je dostupné v každom vedeckom zariadení, a už vôbec nie na Slovensku.

Preto je efektívnejšie využívať systémy, ktoré umožňujú sledovať interakcie vírus-bunka bez potreby budovania špeciálnych laboratórií, čo je ekonomicky aj technicky náročné. Riešením týchto problémov je použitie technológie vírusových častíc podobných vírusu (VLP), ktoré umožňujú bezpečné a spoľahlivé štúdium týchto interakcií.

Je to vírus alebo to nie je vírus?

VLP častice sú štruktúry, ktoré napodobňujú vírusy, ale neobsahujú vírusový genetický materiál. To je hlavný dôvod, prečo sa nedokážu replikovať ako skutočné vírusy a tým pádom sú NEINFEKČNÉ.

Čo všetko sa dá s využitím týchto štruktúr študovať? Okrem riešenej problematiky interakcie vírus-bunka sa dajú tieto častice aplikovať aj v iných oblastiach medicíny vrátane vývoja vakcín, dodania liečiva priamo do buniek alebo na génovú terapiu.

Svetielkujúci koronavírus: Ako rozžiariť SARS-CoV-2 pod mikroskopom

Ako už bolo spomenuté, vírus je komplexná skladačka, v ktorej má každý dielik svoju úlohu. SARS-CoV-2 tvoria, okrem iných, štyri základné proteíny – S, E, M a N – ktorých prítomnosť je kľúčová pre zostavenie SARS-CoV-2 VLP.

Skutočné umenie a kreativita spočívajú v pripojení fluorescenčnej značky k týmto základným proteínom. Táto jednoduchá modifikácia nám umožňuje vizualizovať VLP častice v reálnom čase pomocou fluorescenčnej mikroskopie.

Ako však vytvoriť tieto modifikované proteíny? Teoreticky je to náročné a prakticky (bohužiaľ) ešte viac. V zásade je potrebné použiť metódy molekulárnej biológie, čo znamená pripraviť kruhovú DNA (tzv. plazmid), ktorá nesie informáciu o požadovanom proteíne vírusu. Tento "nosič" genetickej informácie obsahuje okrem samotného génu aj prídavnú sekvenciu pre fluorescenčnú značku. To umožní, aby daný vírusový proteín svietil vo fluorescenčnom mikroskope, čím ho môžeme priamo sledovať.

Tieto plazmidy, ktoré obsahujú gény pre všetky základné proteíny (niektoré aj s fluorescenčnou značkou), vložíme do vhodných buniek používaných na produkciu vírusov. Tieto bunky následne vyprodukujú požadované fluorescenčne značené VLP častice.

Svieti to, rozpoznáva to správny receptor. Dobre, ale....

Vytvorenie SARS-CoV-2 VLP, ktoré rozpoznávajú správny receptor, vstupujú do bunky prostredníctvom endocytózy a svietia vo fluorescenčnom mikroskope, je síce kľúčové, no na štúdium interakcie medzi vírusom a bunkou je rovnako dôležité zvoliť optimálny bunkový model.

Mnohé bunky ľudského tela obsahujú na svojom povrchu receptor ACE2, ktorý je nevyhnutný pre vstup vírusu (alebo v našom prípade VLP) do bunky. Bunky srdca, obličiek, čriev a najmä pľúc majú veľké množstvo tohto receptora. Ale ako vybrať ten správny model?

Ideálny model by mal byť dostupný, ľahko udržiavateľný a nesmrteľný. Preto sú rakovinové bunky vhodným kandidátom, keďže spĺňajú všetky tieto požiadavky. Ako optimálne bunky na štúdium interakcie SARS-CoV-2 sa ukázali línie kolorektálneho karcinómu, pľúcneho adenokarcinómu a hepatocelulárneho karcinómu.

Výber vhodného modelu máme vyriešený. Čo ďalej? Moderné metódy génových manipulácií nám umožňujú vylepšiť tieto modelové systémy. Jedným z najefektívnejších nástrojov, ktoré dnes veda na tento účel využíva, sú lentivírusy.

Ako vírusy využiť v náš prospech

Metódou génového inžinierstva dokážeme vytvoriť rekombinantné (zložené) lentivírusy, ktoré sú najbežnejším vírusovým vektorom na efektívne zavádzanie génov do buniek cicavcov. Hlavnou výhodou tohto prístupu je, že nám dáva schopnosť začleniť cudzorodý gén priamo do genómu hostiteľskej bunky, čím získavame možnosť využívať tento gén pri štúdiu interakcií medzi vírusom a bunkou.

V našej štúdii, zameranej na analýzu tejto interakcie, sme modifikovali líniu hepatocelulárneho karcinómu. A to takým spôsobom, že sme do nej vložili gén pre produkciu malých fluorescenčne značených proteínov, tzv. nanobody, ktoré boli označené červenou značkou.

Tieto nanobody sa špecificky viažu na modifikovaný N proteín, ktorý je tiež fluorescenčne označený, no tentokrát zelenou farbou, a nachádza sa v našich VLP časticiach. Šikovné riešenie tejto väzby spočíva v tom, že N proteín obsahuje okrem informácie o samotnom proteíne a florescenčnom signáli aj dodatočnú informáciu o tzv. ALFA-tag. ALFA-tag je krátka sekvencia aminokyselín pridaná k proteínu, ktorá slúži ako značka.

Tento ALFA-tag funguje ako vysoko-špecifický diel skladačky, ktorý sa viaže len na ďalší špecifický dielik – v našom prípade nanobody. Výsledkom je spojenie oboch proteínov v bunke, pričom ich môžeme sledovať vďaka odlišným fluorescenčným farbám prostredníctvom fluorescenčnej mikroskopie. Tento prístup nám umožňuje detailne analyzovať časovo-priestorovú dynamiku vstupu SARS-CoV-2 VLP do bunky.

Čo nás čaká v najbližších rokoch v oblasti štúdia interakcie vírus-bunka vo svete a na Slovensku?

Až donedávna bola jedinou možnosťou vizualizácie vírusov elektrónová mikroskopia. Tento prístup má však zásadnú nevýhodu – vírus je pri ňom usmrtený, čo znemožňuje štúdium vírusov v živých bunkách.

Prelom v tejto oblasti priniesla fluorescenčná technológia v kombinácii s rozvojom génového inžinierstva, ktorá umožňuje priamo pozorovať interakciu medzi vírusmi a živými hostiteľskými bunkami v reálnom čase.

Z pohľadu človeka, ktorý mal možnosť zúčastniť sa podobného projektu v zahraničí, môžem povedať, že aj keď na Slovensku máme stále isté rezervy v technickom zabezpečení pre tento typ výskumu, tento nedostatok kompenzujeme vysoko kvalifikovanými odborníkmi, ktorí sú žiadaní po celom svete. Udržiavanie a rozvíjanie medzinárodných spoluprác tak umožňuje aj slovenskej vede zúčastniť sa na svetových výskumných projektoch.

Financované Vedeckou grantovou agentúrou Ministerstva školstva, vedy, výskumu a športu Slovenskej republiky VEGA č. 1-0261-22.

RNDr. Marek Samec, PhD.

• Absolvent Prírodovedeckej fakulty UK v Bratislave v odbore Molekulárna biológia.
• Počas svojej diplomovej práci sa venoval identifikácii nových baktériofágov infikujúcich oportúnne patogénne kmene baktérii.
• Odborný asistent na Ústave lekárskej biológie Jesseniovej lekárskej fakulty UK v Martine.
• Spoluriešiteľ projektu zameraného na analýzu časovo-priestorovej dynamiky vstupu SARS-CoV-2 VLP do bunky. Spoluautor práce zameranej na detekciu SARS-CoV-2 v odpadových vodách metódami molekulárnej biológie.
• Absolvent zahraničnej stáže v Montpellier v CNRS (Centre national de la recherche scientifique), konkrétne v inštitúte IRIM (Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier). V rámci tejto stáže som si osvojil najmodernejšie postupy a technológie v oblasti virológie a bunkovej biológie, ktoré sa aktuálne snažím aplikovať aj na Slovensku.